Методи

мышьУ своїй роботі ми використовуємо умовнонокаутних та трансгенних тварин а також ізольовані кардіоміоцити

Уся експериментальна робота планується і виконується згідно DIRECTIVE 2004/9/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 11 February 2004 стосовно інспекції та перевірки «хорошої лабораторної практики» (GLP). Усі процедури з тваринами узгоджені та дозволені комітетом з Біоетики ІМБГ та службою віварію ІМБГ

MHC–Cre трансгенні миші »

MHC–Cre трансгенні миші експресують бактеріальну Cre-рекомбіназу під контролем промотору важкого ланцюга α-міозину (αMHC або alpha-MHC; Myh6), Варто зауважити, що у нашій моделі Cre-рекомбіназа активна лише під контролем тканино-специфічного промотору і виключно у кардіоміоцитах починаючи з 6 – 7 доби ембріонального розвитку. Тобто після утворення серцевої трубки. Тварини генеровані Dr.Michael Schneider (Baylor College of Medicine, United States) та люб’язно надані у наше розпорядження Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

Індуцибельні α MHC–Cre трансгенні миші »

Індуцибельні α MHC–Cre трансгенні миші або alpha-MHC-MerCreMer (αMHC-MerCreMer) ці трансгенні тварини мають кардіоспецифічний промотор (αMHC or alpha-MHC; Myh6) що регулює експресію тамоксифен – залежної Cre рекомбінази (MerCreMer) як у дорослих так і новонароджених кардіоміоцитах. Ці αMHC-MerCreMer трансгенні миші дають змогу створювати бітрансгенних особин що містять Cre-lox сайти і спрямовано керувати делецією loxP-фланкоаних ділянок геному у серцевих клітинах/тканині. Тварини були створені та описані Philippe Soriano; депозит у Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) та люб’язно надані нам Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

R26R репортерні миші (або B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J) »

R26R репортерні миші (або B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J) можуть використовуватись як Cre-репортерні лінії; для оцінки експресії cre у клітинах чи тканинах трансгенних тварин. Ці тварини експресують бактеріальну бета-галактозидазу (lacZ) після схрещування з Cre трансгенними лініями, експресія lacZ спостерігається у тканинах і клітинах де є наявною експресія cre-рекомбінази. Миші були створені та описані Philippe Soriano; депозит у Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) та люб’язно надані нам Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

BAT-GAL трансгенні миші »

BAT-GAL трансгенні миші (також називаються β-catenin/TCF/LEF репортері трансгенні миші) репортерна лінія тварин що експресують бета галактозидазу лише у присутності активного beta-катеніну (транскрипційного ко-активатора канонічного Wnt сигналінгу). Ці тварини використовуються для ідентифікації мутацій що впливають на Wnt-сигнальний шлях, та виявлення популяцій клітин де Wnt-сигналінг та beta-катенін є активними під час ембріонального розвитку чи розвитку патологій дорослого організму. Тварини люб’язно надані у наше розпорядження Dr Mathew Weller та Prof Thomas Brown (Max-Planck-Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

Ncad flox/floxмиші »

Ncad flox/floxмиші це мутантні тварини, містять у своєму геномі loxP сайти що фланкують екзон 1 гену Cdh2(або Ncad). Ця лінія мишей була створена Dr Igor Kostestkii та Dr. Glenn Radice і люб’язно надана у наше розпорядження Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

α-E-catenin flox/flox миші »

α-E-catenin flox/flox миші ці умовнонокаутні миші, містять у своєму геномі loxP сайти що фланкують екзон 2 гену Ctnna1 (α-E-catenin ). Миші були отримані із Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) і люб’язно надані у наше розпорядження Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

βcatenin flox/flox миші »

βcatenin flox/flox миші тварини містять у своєму геномі loxP сайти що фланкують інтрони 1 та 6 гену –мішені (β-катенін). Тварини були генеровані із використанням бластоцист мишей лінії C57BL/6J та мишей лінії C57BL/6J Миші були отримані із Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) і люб’язно надані у наше розпорядження Dr. G. L. Radice (Jefferson Medical College, USA).

Wif1 flox/flox миші »

Wif1 flox/flox  миші ці умовнонокаутні миші містять у своєму геномі loxP сайти у нітроні гену – мішені (Wif1). Білок, що кодується цим геном інгібує WNT білки, що мають функцію позаклітинних сигнальних молекул  і відіграють важливу роль у ембріональному розвитку. Цей білок містить домен фактору інгібування (WIF) та домен епідермального фактору росту (EGF). Тварини були створені та люб’язно надані у наше розпорядження Dr Mathew Weller і Prof Thomas Brown (Max-Planck-Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

 

Для отримання специфічної делеції гену – мішені виключно у кардіоміоцитах, ми схрещуємо мишей що експресують бактеріальну Cre-рекомбіназу під контролем важкого ланцюга α-міозину ((αMHC)–Cre) та є гетерозиготами за умовним нокаутом досліджуваного гену (наприклад β-катеніну) і мають генотип: (αMHC)–Cre; β-cat flox/wt з тваринами гомозиготними за умовним нокаутом досліджуваного гену з генотипом: β-cat flox/flox. Аналогічна схема схрещувань використовується і для генерації тварин із делецією інших генів.

Модель тривалих фізичних навантажень для розвитку гіпертрофії серця

Самці мишей віком 3 місяці як контрольної так і дослідної групи (з делеціює досліджуваного гену) отримують фізичне навантаження протягом 6 тижнів (таким чином розвивається гіпертрофія або серце атлета). Протокол плавального тесту було адаптовано з (Evangelista FS, Brum PC, Krieger JE. 2003).

Ізольовані кардіоміоцити

Методи: виділення та культивування клітин, робота з лабораторними мишами, маніпуляції із тваринами: IV, IP та IM ін’єкції, оперування мишей; MTT- тест; ГЕ- забарвлення, MT- забарвлення, забарвлення по Ван
Гізену, Імуногістохімія; приготування парафінових блоків зразків тканин; виділення білків та Вестерн блот; ПЛР; ПЛР у реальному часі; иділення ДНК та РНК; ChIP-PCR та  ChIP-seq. Статистичні методи аналізу: одно – і дво факторний дисперсійний аналіз (ANOVA test); Коефіцієнт варіативності; тест Стюдента; Біоінформатичний аналіз