Дослідження

Серце є першим органом, що формується у процесі ембріогенезу і постійно працює протягом усього життя організму, адаптуючись до фізичних, гормональних та вікових навантажень. У нашій попередній роботі (робота була розпочата Dr. Igor Kostetskii спільно з Dr Glenn Radice, у рамках гранту CRDF) ми показали, що клітинна адгезія, а саме N-кадгерин-катеніновий комплекс має принципове значення для кардіогенезу. Кардіоспецифічний умовний нокаут N-кадгерину спричиняє порушення розвитку ембріонального серця та призводить до летальності (Рис. 1). Делеція цитоплазматичних партнерів N-кадгерину: β-катеніну або αE-катеніну у ембріональному серці не спричиняла порушень розвитку серця ембріону. Однак ми спостерігали летальність новонароджених тварин та ембріонів на пізніх стадіях розвитку після делеції β-катеніну. Ми припускаємо що на відміну від N-кадгерину, β-катенін є важливим для розвитку серця через його сигнальну функцію. Як відомо β-катенін важливий транскрипційний ко-активатор канонічного Wnt сигналінгу.

ембріони-2

 

Рис 1 Кардіоспецифічна делеція гена N-кадгерина призводить до порушення адгезії кардіоміоцитів і ембріональної летальності. Зображення ембріону дикого типу (а) та N-кадгерин СКО (б) ембріонів E10.5. У мутантних ембріонів спостерігали порушення структури серця та набряк перикарду (стрілка). Гістологічний аналіз зразків дикого типу (с, е) і N-кадгерин СКО (d, f) E10.5 ембріонів. Зверніть увагу на менш компактний шар клітин стінки ембріонального серця (стрілка) у мутантних ембріонів (F)

Канонічний Wnt сигналинг один із головних сигналінгів, що залучено до контролю клітинного циклу, проліферації, апоптозу та диференціювання багатьох тканин та органів включаючи серце. Показано, що за умови делеції β-катеніну його структурна функція і клітинна адгезія підтримується плакоглобіном. Плакоглобін (γ-катенін) має високу гомологію до β-катеніну, і на відміну від β-катеніну, він може взаємодіяти з обома класичними кадгеринами і у структурі АК (адгеринових комплексів) і у структурі десмосом. Окрім того у своїх експериментах ми спостерігали активацію канонічного Wnt сигналінгу у серцях новонароджених тварин із дефіцитом β-катеніну (активація експресії генів Axin2, TCF4 та c-Fos). Цікаво також, що у цих же дослідних зразках спостерігали і підвищення експресії гену плакоглобіну. На нашу думку, плакоглобін і β-катенін здатні до комплексної взаємодії у регуляції специфікації клітини і можливо також у кардіогенезі. Така функціональна компенсація у регуляції канонічного Wnt сигналінгу скоріш за все є слабкою та/або не ефективною у пізньому кардіогенезі. Нині спільно із Dr. Cecilia Winata та застосуванням методу ChIP-seq ми досліджуємо головні рушійні механізми у розвитку серця. Ми плануємо з’ясувати сигнальну функцію плакоглобіну у регуляції кардіогенезу, а також проаналізувати можливість функціональної компенсації між β-катеніном та плакоглобіном. Низка робіт свідчить що деякі Wnt фактори залучені у розвиток гіпертрофії серця та регенерації серця після експериментального інфаркту міокарду. Однак сигнальна функція β-катеніну у регуляції адаптації дорослого серця до гемодинамічного навантаження, старіння, гормонального або фізичного стресу нині не до кінця з’ясована. У своїй роботі із використанням β-катенін CKO мишей та ізольованих кардіоміоцитів ми показали, що делеція β-катеніну призводить до затримки специфікації та визрівання неонатальних кардіомоіцитів. У результаті чого повна втрата β-катеніну у кардіоміоцитах є летальною, тоді як часткова втрата гену пов’язана із підвищеним рівнем експресії фетальних або гіпертрофічних генів (ANP, BNP та β-MHC) у дорослих тварин. Ми спостерігали гіршу адаптацію тварин з дефіцитом гену β-катеніну до тривалих фізичних навантажень і водночас – активацію Akt кіназного та ERK ½ сигналінгів. Разом із Dr Pawel Dobrzun ми вивчаємо порушення метаболізму жирних кислот у тварин із дефіцитом гену β-катеніну (Western blots, тонкошарова та газова хроматографія) та як саме останній залучено до регуляції метаболізму серця. Ми вважаємо, що сигнальна функція β-катеніну необхідна як для визрівання та специфікації кардіоміоцитів у новонародженому серці так і для адаптації дорослого серця до стресових факторів. Із використанням BATGal трансгенних мишей ми проаналізували сигнальну функцію канонічного Wnt та β-катеніну у розвитку патологічної гіпертрофії. Тваринам були імплантовані міні-осмотичні насоси (Aztech) з фізіологічним розчином або AngII протягом 3, 7 або 14 діб (Рис 2).

nos2_00027

Рис 2. β-катеніноий сигналінг активується під впливом гіпертрофічних стимулів (AngII та LiCl). З використанням BatGal мишей ми виявили позитивне забарвлення кардіоміоцитів на β-галактозидазу на 3-й день досліду ( показано стрілкою). За допомогою qPCR ми виявили підвищення експресії гену TCF4 у тварин що отримували гіпертрофічні стимули порівняно із контролем.

У результаті (спільно із Dr. Mathew Weller) ми спостерігали активацію Wnt сигналінгу через 3 доби після перфузії AngII, а також підвищення експресії генів-мішеней β-катеніну та фетальних генів. Загалом наші дані свідчать про те що Wnt сигналінг статистично вірогідно активується на ранніх стадіях гіпертрофії після чого, на пізніх термінах формування патології, вочевидь пригнічується. α-E-катенін більше відомий завдяки своїй важливій структурній функції у підтриманні АК. Однак протягом останньої декади було показано, що α-катенін модулює активність Hippo-, Wnt-, Hedgehog- та NF-kB сигнальних шляхів. Однак, сигнальна функція α-E-катеніну у серці практично не з’ясована. Тож у наших нинішніх дослідженнях ми зосередились на вивченні ролі α-E-катеніну у сигнальній регуляції перебудов дорослого серця.

Ми генерували тварин із ембріональною кардіоспецифічною делецією та дефіцитом гену α-E-катеніну (αMHC-Cre). У своїй роботі ми реєстрували летальність дорослих гомо- та гетерозигот з нокаутом гену α-E-катеніну. Також ми спостерігали нижчий рівень виживаності мутантних тварин (Рис 3).

аЕ-катенін-3Рис. 3 Делеція α-E-катеніну у сердці призводить зменшення виживаності мутантних тварин. Тривалість життя тарин із повною втратою гену α-E-катеніну становила 38 ± 2, для гетерозиготних тварин за втратою досліджуваного гену – 36 ± 3 тижнів, для контрольних тварин 66 ± 4. Максимальна тривалість життя тварин із дефіцитом гену α-E-катеніну становила 48 тижнів, для гетерозиготних тварин за втратою досліджуваного гену – лише 44 тижні; делеція гену α-E-катеніну у ембріональному сердці спричиняє суттеий фіброзис (b) (Balatskii et all 2016)

Делеція α-E-катеніну призводила до гіпертрофії у обох мутантних групах. Окрім того, ми спостерігали вищий рівень експресії гіпертрофічних генів ANP та β-MHC у мутантних тварин. Із застосуванням забарвлення за Ван Гізеном виявили суттєвий фіброз тканини міокарду у мутантних тварин (Рис 3). Усе разом це свідчить про критичну функцію α-E-катеніну у розвитку та перебудовах дорослого серця.